GSH磁珠(GSH Magnetic Beads),是由長(zhǎng)臂環(huán)氧基活化的順磁性瓊脂糖微球與還原性谷胱甘肽共價(jià)偶聯(lián)形成的復(fù)合微粒,,其配體能夠特異性的結(jié)合谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白,,該產(chǎn)品可通過(guò)磁性設(shè)備一步式快速獲得GST 標(biāo)簽蛋白。尤其適用于同時(shí)純化多個(gè)
樣品,,樣本和磁珠的體積范圍也可靈活的調(diào)整,,純化的過(guò)程能夠簡(jiǎn)便的放大,配備磁力架或者知禾泰克PP系列高通量自動(dòng)化蛋白純化工作站可同時(shí)處理1-96 個(gè)樣本,。
磁珠的參數(shù)和指標(biāo)見(jiàn)Table 1,,產(chǎn)品規(guī)格見(jiàn) Table 2。
Table 1:GSH磁珠參數(shù)和性能指標(biāo)
基質(zhì) | 瓊脂糖 |
配基 | Protein L |
粒徑 | 10-37μm |
GST 融合蛋白結(jié)合能力(載量) | ≥5mg/mL(磁珠純體積) |
磁珠濃度 | 20%(v/v) |
儲(chǔ)存溫度 | 2-8℃ |
保質(zhì)期 | 2年 |
Table 2:產(chǎn)品規(guī)格
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 磁珠濃度 | 規(guī)格 |
GSH磁珠 | MG701 | 20% v/v磁珠 | 5ml |
MG702 | 20% v/v磁珠 | 50ml |
注意:GSH磁珠,,2-8℃ 保存,,不要冷凍,禁止磁珠在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中變干,。
本產(chǎn)品須與磁性分離器配套使用
磁珠使用前要混合震蕩均勻
磁珠預(yù)處理要充分
孵育時(shí)要保持磁珠處于懸浮狀態(tài),,以保持最大結(jié)合效率
在使用及保存磁珠過(guò)程中,禁止磁珠長(zhǎng)時(shí)間干燥
禁止冷凍,,離心磁珠,,防止對(duì)磁珠產(chǎn)生不可逆的損傷
建議磁珠僅重復(fù)純化同種蛋白
應(yīng)避免磁珠因磁吸不完全導(dǎo)致的磁珠損耗
用后及時(shí)再生,避免將磁珠長(zhǎng)時(shí)間置于低pH的緩沖液中,,避免磁珠長(zhǎng)菌
適用于GST標(biāo)簽融合蛋白的純化,,配備磁力架或者知禾泰克PP系列高通量自動(dòng)化蛋白純化工作站可同時(shí)處理1-96 個(gè)樣本。
Binding/ Wash Buffer | PBS,,pH7.4(137mM NaCl,,2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4) |
Elution Buffer | 50mM Tris-HCl,10-20mM 還原型谷胱甘肽,,pH8.0(現(xiàn)配現(xiàn)用) |
Storage buffer | PBST(含0.05% NaN3)或20%乙醇 |
以大腸桿菌表達(dá)的GST標(biāo)簽融合蛋白的純化為例
1) 將收集到的菌體,,加入適量體積的Binding buffer,加入蛋白酶抑制劑(如終濃度為
1mM 的PMSF),;加入溶菌酶,,使終濃度為0.2-0.4mg/mL。
2) 將菌體懸浮起來(lái),,置于冰上進(jìn)行超聲波破碎,,如果破碎后的樣本過(guò)于粘稠,可加入適
量核酸酶在冰上孵育30mins,,獲得的即為粗蛋白樣品,。
1) 磁珠的使用量可根據(jù)目標(biāo)蛋白產(chǎn)量來(lái)計(jì)算,,磁珠使用量可稍過(guò)量,如目標(biāo)蛋白預(yù)估產(chǎn)
量為5mg,,則加入5-10mL(20%,,v/v)磁珠。
2) 磁珠平衡:將磁珠充分渦旋混勻,,然后立即取出所需磁珠加入到離心管中,,置于磁力
架上磁吸,吸棄上清液,;加入與懸浮磁珠等體積的Binding buffer,,渦旋15s,然后置于磁
力架上磁吸,,澄清后,可翻轉(zhuǎn)離心管(保持離心管在磁力架上),,使離心管蓋上殘留的磁
珠潤(rùn)洗下來(lái),,待上清澄清后去掉上清液,重復(fù)洗滌2 次,。
將粗蛋白樣品加入到上述平衡后的磁珠管中,,蓋上管蓋,將磁珠置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上室
溫混合20-30mins(如有需要,,也可于2-8℃下旋轉(zhuǎn)混合1h),。
1) 將上述離心管置于磁力架上,待上清澄清后,,吸取上清液至新的離心管中以備檢測(cè),。
2) 加入等體積的Wash buffer 重懸磁珠,吹打5-10 次或旋轉(zhuǎn)2mins,,然后將離心管置于
磁力架上,,上清澄清后,吸取上清液到新的離心管中以備檢測(cè),,重復(fù)該洗滌步驟至少2 次,。
1) 根據(jù)需要,加入適量的Elution Buffer 于磁珠管中,,吹打混勻后,,將離心管置于旋轉(zhuǎn)
儀上混合5-10mins;
2) 將離心管置于磁力架上,,待上清澄清,,吸取上清液保存?zhèn)溆茫蝗缬行枰?,可重?fù)該步
驟一次,,收集樣品到新的離心管中,,以檢測(cè)目標(biāo)蛋白是否完全洗脫。
1) 向磁珠中加入Elution Buffer,,渦旋震蕩30s,,然后磁吸去上清,共洗滌3 次,;
2) 向磁珠中加入4 倍磁珠體積的20%乙醇,,置于2-8℃保存。
上述流程為推薦流程,,根據(jù)目標(biāo)蛋白的不同,,可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行流程上的優(yōu)化,
以獲得更高的回收率和純度,。
1) 調(diào)整粗蛋白濃度,,如蛋白濃度過(guò)低,則不利于蛋白的回收,;
2) 調(diào)整磁珠用量,、孵育時(shí)間、洗脫時(shí)間,、洗脫次數(shù)等,;
3) 緩沖液中加入1~10mM 的DTT,有利于部分GST 標(biāo)簽蛋白與磁珠的結(jié)合,;
4) 緩沖液中加入0.05%的Tween-20 可降低磁珠和離心管對(duì)非特異蛋白的吸附,。
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