產(chǎn)品介紹

Table 1：NI NTA Magnetic Beads 參數(shù)和性能指標(biāo)

Table 2：試劑和規(guī)格

使用須知

本產(chǎn)品須與磁性分離設(shè)備配套使用

磁珠使用前要混合震蕩均勻

磁珠預(yù)處理要充分

孵育時(shí)要保持磁珠處于懸浮狀態(tài),，以保持最大結(jié)合效率

在使用及保存磁珠過(guò)程中，禁止磁珠長(zhǎng)時(shí)間干燥

禁止冷凍,，離心磁珠,，防止對(duì)磁珠產(chǎn)生不可逆的損傷

建議磁珠僅重復(fù)純化同種蛋白，當(dāng)純化性能降低時(shí),，可進(jìn)行再生處理

應(yīng)避免磁珠因磁吸不完全導(dǎo)致的磁珠損耗

使用方法

1. 常用緩沖液

緩沖液的配制影響目的蛋白的回收率和純度,，在純化較大規(guī)模蛋白之前，需做好預(yù)實(shí)驗(yàn),，篩選出適用于目的蛋白的緩沖液體系,。

在結(jié)合緩沖液中添加少量咪唑可以減少雜蛋白的吸附；洗脫時(shí),，不確定最佳洗脫咪唑濃度的情況下,，推薦使用不同梯度洗脫，并收集上清液做 SDS-PAGE 電泳驗(yàn)證,，確定合適的洗脫濃度,。

2.  手動(dòng)純化流程

2.1 樣品制備

細(xì)胞分泌表達(dá)的樣品直接用Binding Buffer稀釋2-3倍，混合均勻備用,；

細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)的樣品,，用 Binding Buffer 重懸，按需加入蛋白酶抑制劑（例如：終濃度為 1 mM的 PMSF）,，攪拌混合均勻，冰浴超聲裂解細(xì)胞備用,。

2.2 磁珠預(yù)處理

取一定量磁珠至 EP 管中,，置于磁力架上，使磁珠沉降,，移除上層的 Storage Buffer,，用與Storage Buffer等體積的 Binding Buffer （例如取400ul 10% V/V的磁珠，磁珠體積是40ul,， Storage Solution的體積是360ul,，這里加入360ul）洗滌 2-3 次,，磁性分離后加Binding Buffer調(diào)整磁珠體積比為10%，保留磁珠備用,。

2.3 結(jié)合

將磁珠加入步驟 2.1 的樣品中,，在室溫下使用混合儀或搖床翻轉(zhuǎn) EP 管，使磁珠充分的分散在樣品溶液中,，約30 min 后進(jìn)行磁性分離,，移出上清液，留樣檢測(cè)或廢棄（對(duì)于部分易降解的蛋白,，建議在 2~8℃下孵育 1 h 以上）,。

2.4 漂洗

在上一步 EP 管中加入與Storage Buffer等體積的 Wash Buffer，翻轉(zhuǎn)重懸磁珠后進(jìn)行磁性分離,，移出上清液,，留樣檢測(cè)或廢棄，可根據(jù)需要配制不同咪唑濃度的漂洗液分步漂洗,。

2.5 洗脫

將與Storage Buffer等體積的 Elution Buffer 加入上一步的 EP 管中,，在室溫下使用垂直混合儀或手動(dòng)輕柔翻轉(zhuǎn) EP 管，使磁珠充分的分散,，10 min 后進(jìn)行磁性分離,，移取上清液至新 EP 管，可根據(jù)需要配制不同咪唑濃度的漂洗液分步漂洗,。

注：建議用戶在第一次洗脫后再重復(fù)洗脫 1-2 次,，確保目的蛋白充分回收；微球上 90%結(jié)合的目的蛋白在第一次洗脫時(shí)會(huì)被洗脫,，因此,，之后的洗脫時(shí)間及洗脫液體積均可自定義，翻轉(zhuǎn)混合均勻后磁性分離即可,。

2.6 磁珠后處理

使用后的磁珠用 Elution Buffer 洗滌 2 次,，磁性分離后移除上清液；之后用去離子水洗

滌 2 次,，磁性分離后移除上清液,；加入 Storage Solution 使磁珠濃度為 10%（v/v），置于 2-8℃保存,。

3. 磁珠再生

Ni NTA Magnetic Beads 瓊脂糖磁珠在連續(xù)使用 8~10 次后,，若出現(xiàn)載量明顯下降的現(xiàn)象時(shí)，表明螯合的 Ni2+有部分脫落,，建議進(jìn)行再生處理,，需準(zhǔn)備以下緩沖液。

具體操作流程如下：

（1）取結(jié)合性能降低的磁珠至EP 管中,，磁性分離移除上清液,，加入3倍磁珠體積的 Stripping Buffer，重懸磁珠,，在 37℃搖床內(nèi)震蕩混合 30 min,，磁性分離，去除上清液,，重復(fù) 1 次,；

（2）加入3倍磁珠體積的去離子水，手動(dòng)翻轉(zhuǎn) EP 管使磁珠重懸,，磁性分離后移除上清液,，重復(fù) 2 次；

（3）加入3倍磁珠體積的 Beads Washing Buffer,，在室溫下使用垂直混合儀或手動(dòng)輕柔翻轉(zhuǎn) EP 管,，使磁珠重懸，5 min 后磁性分離移除上清液,；加入3倍磁珠體積的去離子水,，手動(dòng)翻轉(zhuǎn) EP 管使磁珠重懸，磁性分離后移除上清液,，重復(fù) 3~5 次,，至洗滌液呈中性為止；

（4）加入3倍磁珠體積的 Recharge Buffer,，在室溫下使用垂直混合儀或手動(dòng)輕柔翻轉(zhuǎn)EP 管,，使磁珠重懸，5 min 后磁性分離移除上清液,，重復(fù) 2 次,；用去離子水洗滌磁珠 5 次以上，確保游離的 Ni2+去除完全,；

（5）加入 Storage Solution 使磁珠濃度為 10%（v/v）,，置于 2-8℃保存。

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