雜交瘤技術(shù)簡(jiǎn)介

雜交瘤一般是指我們將骨髓瘤細(xì)胞和免疫B淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合,，形成能分泌高度純一單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的技術(shù)，由諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者Georges Kohler和Cesar Milstein于1975年發(fā)明,?？贵w是由免疫的B淋巴細(xì)胞分泌的球蛋白，各個(gè)淋巴細(xì)胞分泌的抗體各不相同,，因而要獲得一種獨(dú)特的抗體只有從一個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞群制取,。然而B(niǎo)淋巴細(xì)胞在體外不能長(zhǎng)期存活，分裂2-3次即要死亡,，因而無(wú)法得到由一個(gè)淋巴細(xì)胞的后代細(xì)胞群分泌的大量抗體,。骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下具有無(wú)限繁衍的特性，將免疫B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞,，這種雜交細(xì)胞遺傳雙親細(xì)胞的特性,，既能像B淋巴細(xì)胞一樣分泌抗體，又能像骨髓瘤細(xì)胞一樣無(wú)限增殖,，這樣我們就得到了能夠在體外不斷擴(kuò)增同時(shí)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞,。

雜交瘤技術(shù)基本流程

雜交瘤技術(shù)的基本流程主要包括：免疫抗原制備—?jiǎng)游锩庖摺?xì)胞融合—雜交瘤細(xì)胞篩選—亞克隆及抗體特異性檢測(cè)—抗體大量制備。

（1）免疫抗原制備

一般免疫抗原可選蛋白,、多肽,、小分子等。依據(jù)需求選擇和制備合適的免疫原對(duì)于抗體開(kāi)發(fā)至關(guān)重要,。

知禾特色：可根據(jù)客戶(hù)要求定制靶點(diǎn)蛋白

（2）動(dòng)物免疫

通常選用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物,，免疫途徑主要有皮下注射、腹腔注射等,。

常規(guī)免疫周期如下：第一次免疫（抗原+弗氏完全佐劑，皮下注射）,、第二次免疫（抗原+弗氏不完全佐劑,，皮下注射）、第三次免疫（抗原+弗氏不完全佐劑,，皮下注射）,、沖擊免疫（抗原+弗氏不完全佐劑，腹腔注射）,。

知禾特色：采用獨(dú)特的水溶性免疫佐劑,，5周即可達(dá)到常規(guī)佐劑免疫8周的同等效果，同時(shí)可為客戶(hù)根據(jù)抗原的特性制定免疫方案,。

（3）細(xì)胞融合

①骨髓瘤細(xì)胞制備：

骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)該和免疫動(dòng)物屬于同一品系,，融合前骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，融合前培養(yǎng)不能少于1周,；凍存復(fù)蘇后的骨髓瘤細(xì)胞要生長(zhǎng)2周才可達(dá)到適用于融合的狀態(tài),。
②飼養(yǎng)細(xì)胞制備：

通常在融合前一天,，采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和正常脾細(xì)胞作為融合飼養(yǎng)層。飼養(yǎng)細(xì)胞釋放生長(zhǎng)刺激因子,，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長(zhǎng)條件,，此功能也可通過(guò)添加相應(yīng)細(xì)胞因子代替；同時(shí)飼養(yǎng)細(xì)胞也可滿(mǎn)足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴(lài)性,。

③脾細(xì)胞制備：

小鼠處死前摘眼球取血,，分離血清作為檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照。取免疫小鼠的脾臟,，研磨,、過(guò)濾、離心后可得脾細(xì)胞,，通常每只免疫小鼠可得約1x108個(gè)脾細(xì)胞,。

④細(xì)胞融合：細(xì)胞融合方法有病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合、聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)細(xì)胞融合,、電融合,。PEG是使相鄰細(xì)胞質(zhì)膜融合，形成具有兩個(gè)或更多核的單細(xì)胞,。電融合是通過(guò)施加脈沖電場(chǎng)連接相鄰細(xì)胞的膜,。電融合比PEG更加有效，結(jié)果具有重現(xiàn)性,。

知禾特色：采用高效電融合促進(jìn)劑,，一次融合最多100-200塊96孔板

（4）雜交瘤細(xì)胞篩選

細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理學(xué)過(guò)程，融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn),。因此要利用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞,，HAT培養(yǎng)基中有3種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤(hypoxanthine，H),、甲氨蝶呤(aminopterin,，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T),。

正常細(xì)胞的核苷酸合成有兩個(gè)途徑：全合成途徑和補(bǔ)救合成途徑,。全合成途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA,，該過(guò)程會(huì)被A阻斷,；補(bǔ)救合成途徑是在H和T存在的情況下，經(jīng)過(guò)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化合成核苷酸,，進(jìn)而合成DNA,，而所用的骨髓瘤細(xì)胞缺乏HGPRT而不能通過(guò)補(bǔ)救合成途徑合成DNA，使得骨髓瘤細(xì)胞不能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中僅能存活5-7天,，無(wú)需特別篩選,，因此只有融合的雜交瘤細(xì)胞，可在HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活與繁殖,。培養(yǎng)7-10天后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞群,。

（5）雜交瘤亞克隆及抗體特異性檢測(cè)

將融合后抗體高分泌性的細(xì)胞群進(jìn)行充分稀釋?zhuān)箍寺〖?xì)胞數(shù)在0-0.5cell/孔之間，改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細(xì)胞株,，將這些陽(yáng)性細(xì)胞再進(jìn)行克隆化,，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，同時(shí)對(duì)所產(chǎn)生抗體進(jìn)行流式檢測(cè),、親和力測(cè)定等相關(guān)檢測(cè),，將定株細(xì)胞增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng),。

知禾特色：使用無(wú)血清細(xì)胞凍存液凍存候選克隆,，延長(zhǎng)檢測(cè)周期。

（6）單克隆抗體大量制備

利用雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模制備單克隆抗體主要有兩種方式：體外培養(yǎng)法和腹水制備法,。

體外培養(yǎng)可以采用單層細(xì)胞培養(yǎng)的形式,，也可以采用懸浮培養(yǎng)的形式。如果想在體外高效率地大量制備單克隆抗體,，就必須高密度培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,，充分利用培養(yǎng)基的立體空間。單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量越多,，產(chǎn)生的單克隆抗體就越多,，濃度就越高，產(chǎn)量就越大,。

腹水制備法是通過(guò)將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生腹水,，可得到大量的腹水單抗。這種方式能夠在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)獲得大量高濃度的抗體,，而且成本低,、操作相對(duì)簡(jiǎn)單。小鼠腹水中常伴有小鼠體內(nèi)的各種雜蛋白,，因此需要純化后進(jìn)行使用，同時(shí)也可能會(huì)有污染動(dòng)物病毒的危險(xiǎn),。

知禾特色服務(wù)：釣基因——因雜交瘤細(xì)胞大多數(shù)都不夠穩(wěn)定,，且窗口期較短，不少科研工作者都困擾于篩選結(jié)果出來(lái)了,，但是細(xì)胞卻已經(jīng)丟失抗體分泌能力,，甚至死亡。

知禾采用小鼠抗體引物，克隆小鼠抗體可變區(qū)和恒定區(qū)基因,，可以永久保留單克隆抗體基因序列信息,，為后續(xù)專(zhuān)利保護(hù)、構(gòu)建基因工程抗體,、抗體人源化打下基礎(chǔ),。

知禾擁有多樣化的雜交瘤細(xì)胞抗體基因測(cè)序方案和豐富的測(cè)序經(jīng)驗(yàn)，目前已累計(jì)交付1000+測(cè)序訂單,。