雜交瘤技術簡介

雜交瘤一般是指我們將骨髓瘤細胞和免疫B淋巴細胞進行融合,，形成能分泌高度純一單克隆抗體的雜交瘤細胞的技術，由諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲得者Georges Kohler和Cesar Milstein于1975年發(fā)明,。抗體是由免疫的B淋巴細胞分泌的球蛋白,，各個淋巴細胞分泌的抗體各不相同,，因而要獲得一種獨特的抗體只有從一個B淋巴細胞產(chǎn)生的細胞群制取。然而B淋巴細胞在體外不能長期存活,，分裂2-3次即要死亡,，因而無法得到由一個淋巴細胞的后代細胞群分泌的大量抗體。骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)條件下具有無限繁衍的特性,，將免疫B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞,，這種雜交細胞遺傳雙親細胞的特性，既能像B淋巴細胞一樣分泌抗體,，又能像骨髓瘤細胞一樣無限增殖,，這樣我們就得到了能夠在體外不斷擴增同時分泌抗體的雜交瘤細胞。

雜交瘤技術基本流程

雜交瘤技術的基本流程主要包括：免疫抗原制備—動物免疫—細胞融合—雜交瘤細胞篩選—亞克隆及抗體特異性檢測—抗體大量制備,。

（1）免疫抗原制備

一般免疫抗原可選蛋白,、多肽、小分子等,。依據(jù)需求選擇和制備合適的免疫原對于抗體開發(fā)至關重要,。

知禾特色：可根據(jù)客戶要求定制靶點蛋白

（2）動物免疫

通常選用Balb/c小鼠作為免疫動物，免疫途徑主要有皮下注射,、腹腔注射等,。

常規(guī)免疫周期如下：第一次免疫（抗原+弗氏完全佐劑，皮下注射）,、第二次免疫（抗原+弗氏不完全佐劑,，皮下注射）、第三次免疫（抗原+弗氏不完全佐劑,，皮下注射）,、沖擊免疫（抗原+弗氏不完全佐劑，腹腔注射）,。

知禾特色：采用獨特的水溶性免疫佐劑,，5周即可達到常規(guī)佐劑免疫8周的同等效果，同時可為客戶根據(jù)抗原的特性制定免疫方案,。

（3）細胞融合

①骨髓瘤細胞制備：

骨髓瘤細胞應該和免疫動物屬于同一品系,，融合前骨髓瘤細胞應處于對數(shù)生長期，融合前培養(yǎng)不能少于1周,；凍存復蘇后的骨髓瘤細胞要生長2周才可達到適用于融合的狀態(tài),。
②飼養(yǎng)細胞制備：

通常在融合前一天,，采用小鼠腹腔巨噬細胞和正常脾細胞作為融合飼養(yǎng)層。飼養(yǎng)細胞釋放生長刺激因子,，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件,，此功能也可通過添加相應細胞因子代替；同時飼養(yǎng)細胞也可滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性,。

③脾細胞制備：

小鼠處死前摘眼球取血,，分離血清作為檢測時的陽性對照。取免疫小鼠的脾臟,，研磨,、過濾、離心后可得脾細胞,，通常每只免疫小鼠可得約1x108個脾細胞,。

④細胞融合：細胞融合方法有病毒介導的細胞融合、聚乙二醇（PEG）介導細胞融合,、電融合,。PEG是使相鄰細胞質膜融合，形成具有兩個或更多核的單細胞,。電融合是通過施加脈沖電場連接相鄰細胞的膜,。電融合比PEG更加有效，結果具有重現(xiàn)性,。

知禾特色：采用高效電融合促進劑,，一次融合最多100-200塊96孔板

（4）雜交瘤細胞篩選

細胞融合是一個隨機的物理學過程，融合后細胞將以多種形式出現(xiàn),。因此要利用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞,，HAT培養(yǎng)基中有3種關鍵成分：次黃嘌呤(hypoxanthine，H),、甲氨蝶呤(aminopterin,，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T),。

正常細胞的核苷酸合成有兩個途徑：全合成途徑和補救合成途徑,。全合成途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA,，該過程會被A阻斷,；補救合成途徑是在H和T存在的情況下，經(jīng)過次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化合成核苷酸,，進而合成DNA,，而所用的骨髓瘤細胞缺乏HGPRT而不能通過補救合成途徑合成DNA，使得骨髓瘤細胞不能在該培養(yǎng)基中生長,。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中僅能存活5-7天,，無需特別篩選,，因此只有融合的雜交瘤細胞，可在HAT培養(yǎng)基中長期存活與繁殖,。培養(yǎng)7-10天后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細胞群,。

（5）雜交瘤亞克隆及抗體特異性檢測

將融合后抗體高分泌性的細胞群進行充分稀釋，使克隆細胞數(shù)在0-0.5cell/孔之間,，改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細胞株,，將這些陽性細胞再進行克隆化，應用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標抗原的抗體陽性單克隆細胞株,，同時對所產(chǎn)生抗體進行流式檢測、親和力測定等相關檢測,，將定株細胞增殖后進行凍存,、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。

知禾特色：使用無血清細胞凍存液凍存候選克隆,，延長檢測周期,。

（6）單克隆抗體大量制備

利用雜交瘤細胞大規(guī)模制備單克隆抗體主要有兩種方式：體外培養(yǎng)法和腹水制備法。

體外培養(yǎng)可以采用單層細胞培養(yǎng)的形式,，也可以采用懸浮培養(yǎng)的形式,。如果想在體外高效率地大量制備單克隆抗體，就必須高密度培養(yǎng)雜交瘤細胞,，充分利用培養(yǎng)基的立體空間,。單位體積內細胞數(shù)量越多，產(chǎn)生的單克隆抗體就越多,，濃度就越高,，產(chǎn)量就越大。

腹水制備法是通過將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內產(chǎn)生腹水,，可得到大量的腹水單抗,。這種方式能夠在相對短的時間內獲得大量高濃度的抗體，而且成本低,、操作相對簡單,。小鼠腹水中常伴有小鼠體內的各種雜蛋白，因此需要純化后進行使用,，同時也可能會有污染動物病毒的危險,。

知禾特色服務：釣基因——因雜交瘤細胞大多數(shù)都不夠穩(wěn)定，且窗口期較短,，不少科研工作者都困擾于篩選結果出來了,，但是細胞卻已經(jīng)丟失抗體分泌能力，甚至死亡,。

知禾采用小鼠抗體引物,，克隆小鼠抗體可變區(qū)和恒定區(qū)基因,，可以永久保留單克隆抗體基因序列信息，為后續(xù)專利保護,、構建基因工程抗體,、抗體人源化打下基礎。

知禾擁有多樣化的雜交瘤細胞抗體基因測序方案和豐富的測序經(jīng)驗,，目前已累計交付1000+測序訂單,。