一、噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)概述

單抗的制備方法和技術(shù)主要包括免疫血清提取法、雜交瘤技術(shù)、單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體制備技術(shù)和噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)等。在上一篇文章中，我們主要講述了關(guān)于雜交瘤技術(shù)的簡(jiǎn)介和關(guān)鍵點(diǎn)，本篇文章旨在介紹噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)。

簡(jiǎn)介

噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)(phage display antibody library technology, PDAT)是一種新型的單克隆抗體制備技術(shù)，是一種基于噬菌體展示技術(shù)(phage display technology, PDT)的抗體制備技術(shù)。

PDT是由美國(guó)生物學(xué)家Smith于1985年發(fā)明，他通過將外源基因序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因中，使外源蛋白與噬菌體的外殼蛋白融合表達(dá)，并展示在子代噬菌體的表面。PDT突破性地在體外建立了蛋白表型與其遺傳信息的直接聯(lián)系，并保持了蛋白的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。

PDAT能夠在體外模擬體內(nèi)的抗體生成過程，在體外進(jìn)行試驗(yàn)并靈活篩選，可以不經(jīng)雜交瘤途徑，甚至不經(jīng)過免疫就可以制備和生產(chǎn)單克隆抗體，是一種強(qiáng)大的用于制備全人源抗體的技術(shù)手段。其制備抗體不依賴于體內(nèi)的免疫反應(yīng)，可用于發(fā)現(xiàn)針對(duì)幾乎所有類型抗原的抗體，并且結(jié)合了PDT表達(dá)蛋白基因型和表型的統(tǒng)一的特點(diǎn)，通過表型篩選就能得到相應(yīng)的基因，是制備單克隆抗體領(lǐng)域中繼B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)后的又一次飛躍。而且相較于其它單克隆抗體的制備技術(shù)，PDAT具有抗體生產(chǎn)操作簡(jiǎn)單、周期短、抗體結(jié)構(gòu)可塑性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、制備數(shù)量多、抗體產(chǎn)量大、多樣性高和可直接生產(chǎn)人源化抗體等優(yōu)點(diǎn)。

基本原理

PDAT的基本原理是將免疫球蛋白可變區(qū)VH、VL基因重組后整合在噬菌體載體上，并以融合蛋白的形式將抗體表達(dá)到噬菌體表面，再利用這些新噬菌體顆粒感染大腸桿菌，噬菌體在菌體內(nèi)組裝，克隆基因與噬菌體的外殼蛋白基因一同表達(dá)在成熟噬菌體的表面，從而獲得多樣性抗體庫(kù)。抗體庫(kù)經(jīng)過“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過程即可篩選獲得到特異結(jié)合抗原的抗體分子及其基因序列。

類型

1、不同基因來源：

噬菌體展示抗體庫(kù)可根據(jù)抗體基因序列的來源分為免疫抗體庫(kù)和非免疫抗體庫(kù)。

（1）免疫抗體庫(kù)里的抗體基因主要來自于經(jīng)抗原免疫的個(gè)體，采用經(jīng)過免疫后的淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的IgG-mRNA直接建立抗體庫(kù)，由于存在免疫偏好性，因此從該類抗體庫(kù)中容易篩選出針對(duì)與某一特定抗原不同表位、具有不同特異性的高親和力抗體克隆。因?yàn)樵隗w內(nèi)淋巴細(xì)胞已經(jīng)過與抗原的親和力選擇，所以建立小容量的抗體庫(kù)即可篩選出特異性強(qiáng)的高親和力抗體。但是這種抗體庫(kù)有著明顯的缺點(diǎn)，即免疫個(gè)體本身就有限制性和偏好性，且只能產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的特定抗體，其通量小，存在需要進(jìn)行主動(dòng)免疫的缺陷。

（2）非免疫抗體庫(kù)可識(shí)別的抗原具有多樣性，包括那些不引起機(jī)體免疫反應(yīng)的弱抗原、自身抗原和具有毒性的抗原，理論上能夠制備大量的多樣性抗體。非免疫抗體庫(kù)的特點(diǎn)是不針對(duì)特定的抗原，建立多樣性強(qiáng)的抗體庫(kù)，最大可能分離出高親和力的抗體，一般又分為天然抗體庫(kù)、半合成抗體庫(kù)和全合成抗體庫(kù)。

①天然抗體庫(kù)是采用未經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞建立的抗體庫(kù)，可獲得全部的抗體可變區(qū)序列，而且不易遺漏抗體基因，通常是利用未免疫者體內(nèi)IgM-mRNA構(gòu)建而成的，該抗體庫(kù)可用于分離針對(duì)所有類型抗原的抗體，從天然抗體庫(kù)中分離出的抗體親和力主要取決于抗體庫(kù)的多樣性。

②半合成抗體庫(kù)為人工合成一部分可變區(qū)，其余部分來自于天然抗體的合成抗體庫(kù)。而全合成抗體庫(kù)是指可變區(qū)都由人工合成的抗體庫(kù)。

2、不同噬菌體展示系統(tǒng)：

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)可以選擇不同的噬菌體來進(jìn)行抗體的展示，具體可分為T4、T7 、λ 噬菌體和絲狀噬菌體展示系統(tǒng)等。

（1）T4噬菌體是肌病毒科的一種烈性噬菌體。結(jié)構(gòu)相較于絲狀噬菌體更為復(fù)雜，為二十面體結(jié)構(gòu)，具有線性雙鏈DNA。其衣殼蛋白中含有2種非必需外殼蛋白：小外衣殼蛋白(SOC)和高抗原外衣殼蛋白(HOC)，它們不影響噬菌體的正常活性因而可以作為外源基因的結(jié)合位點(diǎn)來展示外源蛋白。T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示多種大小的多肽或蛋白質(zhì)而很少受到限制，并且SOC和HOC蛋白拷貝數(shù)較多，可以進(jìn)行多價(jià)展示。

（2）T7噬菌體是短尾病毒科的一種烈性噬菌體，是一種雙鏈絲狀DNA烈性噬菌體，成熟的噬菌體通過細(xì)胞裂解而釋放，展示在T7表面的多肽或蛋白質(zhì)不需要通過細(xì)胞膜分泌出來，因而其表面展示多肽和蛋白的范圍較廣。在T7噬菌體展示系統(tǒng)中，用于展示多肽和蛋白的衣殼蛋白主要是gp10A和gp10B，其中g(shù)p10B蛋白位于噬菌體表面，用于噬菌體展示系統(tǒng)。T7噬菌體比起絲狀噬菌體的增殖速度更快，可節(jié)省克隆和篩選的時(shí)間，廣泛應(yīng)用于篩選不同分子量、不同親和力的蛋白質(zhì)。

（3）λ噬菌體是長(zhǎng)尾病毒科的一種溫和噬菌體，具有線性雙鏈DNA分子，與T4噬菌體相同為二十面體，主要進(jìn)行裂解性生長(zhǎng)和溶源性生長(zhǎng)，λ 噬菌體中的GPD蛋白和PV尾蛋白常被用來展示多肽或蛋白。λ噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)完成裝配，同樣無需將外源肽或蛋白分泌到細(xì)菌胞膜外，可展示的蛋白質(zhì)范圍極廣。

（4）絲狀噬菌體主要指具有感染革蘭氏陰性菌能力的M13、Fd和F1噬菌體，其中M13噬菌體在噬菌體展示技術(shù)中應(yīng)用最廣泛。

M13噬菌體為一個(gè)絲狀長(zhǎng)管結(jié)構(gòu)，一個(gè)環(huán)狀單鏈DNA基因組編碼5個(gè)外殼蛋白（ｐⅢ、ｐⅥ、ｐⅦ、ｐⅧ和ｐⅨ）以及6個(gè)組裝和復(fù)制蛋白。大多數(shù)噬菌體展示系統(tǒng)基于外殼蛋白ｐⅢ蛋白與ｐⅧ蛋白。ｐⅧ是M13噬菌體上主要的外殼蛋白，可與6-7個(gè)氨基酸大小的外源蛋白融合表達(dá)。而ｐⅢ的拷貝數(shù)較低但可作為表達(dá)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的較大蛋白載體。由于絲狀噬菌體的增殖為非裂解增殖，在增殖期間不會(huì)裂解宿主菌，因此該噬菌體在實(shí)驗(yàn)淘選過程中，只需將菌液離心后取上清并沉淀即可得到噬菌體，減少了因細(xì)胞裂解后需對(duì)噬菌體純化的步驟，縮短了實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間。

3、不同載體類型

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)中常用的載體包括噬菌體載體和噬菌粒載體。

（1）噬菌體載體是基因工程中常用的載體，將外源基因替代或插入到噬菌體基因組當(dāng)中，組成噬菌體載體。大多數(shù)噬菌體載體表面有多個(gè)蛋白展示位點(diǎn)，通常為多價(jià)展示。一般情況下，多價(jià)展示會(huì)使弱結(jié)合性克隆顯示出假陽性，不易篩選特異性高的克隆，但在利用噬菌體展示多肽時(shí)，由于多肽與抗原的結(jié)合能力較弱，反而在多價(jià)展示的情況下更有益于篩選到目的克隆。相反單價(jià)展示可以提高篩選到高親和力克隆的可能性，因此人們選擇利用噬菌粒作為載體，通過單價(jià)展示進(jìn)行高親和力的篩選。

（2）噬菌粒是帶有絲狀噬菌體復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒，是一類人工構(gòu)建的含有絲狀噬菌體包裝序列、復(fù)制子，以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體，兼具絲狀噬菌體與質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)。噬菌粒具有基因組較小可插入較大片段、復(fù)制型為雙鏈DNA、易于操作、轉(zhuǎn)化效率高和產(chǎn)生的重組子更加穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。但由于噬菌粒本身不含噬菌體蛋白編碼基因，導(dǎo)致噬菌粒不能獨(dú)立合成單鏈DNA，在導(dǎo)入大腸桿菌后不產(chǎn)生子代噬菌體，感染時(shí)要用輔助噬菌體，輔助噬菌體編碼的噬菌體蛋白可將絲狀噬菌粒DNA包裝成噬菌體病毒顆粒釋放出來，且能再次感染大腸桿菌而繁殖。

4、不同抗體類型

傳統(tǒng)的全抗體由于分子量較大，不易于展示在噬菌體表面，因此噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)主要用于制備scFv、Fab、二硫鍵穩(wěn)定性抗體(DsFv)、雙鏈抗體(diabody)或小抗體(minibody)等（圖1）。

（1）scFv是利用基因工程的方法將抗體的VH與VL通過一段15?25個(gè)氨基酸的linker連接構(gòu)成的重組蛋白，是具有抗體活性的最小功能結(jié)構(gòu)單位，其分子量約為完整抗體分子的1/6。scFv的優(yōu)勢(shì)是分子量小、穿透力強(qiáng)，但容易形成聚體，構(gòu)建成完整分子后親和力可能會(huì)缺失。

（2）Fab是一種完整抗體的片段，由VH與重鏈恒定區(qū)CH1以及一條完整的輕鏈即VL與輕鏈恒定區(qū)CL組成，二者之間由一個(gè)鏈間二硫鍵連接，形成異二聚體，僅有一個(gè)完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其分子量約為完整IgG分子的1/3。相較于scFv庫(kù)，F(xiàn)ab的形式更接近于完整抗體，其穩(wěn)定性更好，但其表達(dá)水平較低。

（3）DsFv是通過在VH和VL之間形成二硫鍵來穩(wěn)定Fv片段。與scFv相比，DsFv的穩(wěn)定性和親和力更高，同時(shí)也具有scFv小分子的優(yōu)勢(shì)，在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

（4）雙鏈抗體由2個(gè)交叉的單鏈抗體scFv組成，由于連接用的linker將每個(gè)輕鏈重鏈的可變區(qū)分隔開，所以只能形成二聚體。

（5）小抗體通過基因工程手段采用不同的linker把scFv的VH與IgG的重鏈恒定區(qū)CH3融合，形成VL-VH-CH3的結(jié)構(gòu)，稱之為小抗體。

二、噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)流程

使用噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體的基本步驟包括：

1、從體外細(xì)胞中提取總RNA，細(xì)胞類型可選免疫后的動(dòng)物脾細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、末梢血淋巴細(xì)胞、骨髓淋巴細(xì)胞等。

2、反轉(zhuǎn)錄總RNA得到細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，利用PCR技術(shù)以相應(yīng)引物從中擴(kuò)增獲得全套的可變區(qū)基因，包括重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL基因，隨機(jī)拼接VH和VL基因構(gòu)建多樣性的抗體基因庫(kù)。

3、將抗體基因克隆至M13噬菌體表達(dá)載體噬菌粒上，通過電擊方式轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中，并加入輔助噬菌體M13KO7侵染大腸桿菌，使得噬菌體在菌體內(nèi)增殖擴(kuò)增，最后組裝成含有特定抗體或抗體片段基因，并能將抗體表達(dá)展示在表面的重組噬菌體庫(kù)，根據(jù)絲狀噬菌體特性，將菌液離心后取上清，并對(duì)上清中噬菌體進(jìn)行沉淀即可得到針對(duì)某種抗原的初級(jí)噬菌體抗體庫(kù)。

4、選擇特定抗原作為靶點(diǎn)目標(biāo)，對(duì)建立的初級(jí)抗體庫(kù)通常進(jìn)行2?5輪重復(fù)的篩選。在篩選過程中有2個(gè)主要的步驟分別是淘選和單克隆鑒定。

（1）噬菌體的淘選

創(chuàng)建文庫(kù)后，就可使用固定抗原進(jìn)行抗原特異性噬菌體抗體的富集，這一步被稱為噬菌體淘選。淘選分為吸附、洗滌、洗脫和擴(kuò)增4個(gè)過程。

①吸附：需將抗原固定在固相載體上，加入噬菌體抗體庫(kù)后，使得表達(dá)特異性抗體的噬菌體與抗原結(jié)合。

②洗滌：隨著淘選輪數(shù)的增加，逐步減少抗原包被濃度、增大洗滌液中Tween20濃度或逐步增加洗滌次數(shù)，洗去不結(jié)合或結(jié)合較弱的噬菌體，篩選出親和力更高的噬菌體。

③洗脫：洗去未結(jié)合或結(jié)合較弱的噬菌體后，需要洗脫與抗原結(jié)合的高親和力噬菌體。最常用的例如胰酶、甘氨酸、檸檬酸等酸性或堿性緩沖液。但需注意要把洗脫噬菌體的pH值中和到８左右，以避免噬菌體降解或失去感染性。

④擴(kuò)增：結(jié)合的噬菌體從靶標(biāo)上洗脫回收，取少量噬菌體進(jìn)行濃度滴定檢測(cè)，用于后續(xù)根據(jù)投入產(chǎn)出比計(jì)算富集因子；部分重新感染大腸桿菌TG1并加入輔助噬菌體增殖，進(jìn)行下一步淘選和濃縮；剩余部分凍存保種。

（2）單克隆鑒定

經(jīng)過數(shù)輪淘選，與固定相特異性結(jié)合的噬菌體展示目的抗體被富集并分離出來，由于抗體的編碼基因序列與噬菌體載體上的序列一一對(duì)應(yīng)，所以幾輪淘選后，將富集到的與抗原特異性結(jié)合的多克隆噬菌體進(jìn)行單克隆化，即可從多克隆噬菌體中挑選出單克隆噬菌體。

挑選出的單克隆菌株轉(zhuǎn)接至96孔板中，取其單克隆培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果可得到高特異性單克隆菌株，并通過測(cè)序手段獲得由單克隆噬菌體展示的抗體基因。

通過噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的過程省略了細(xì)胞融合過程中繁瑣的步驟，也避免了因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞的不穩(wěn)定性而需要進(jìn)行反復(fù)亞克隆的過程。使得噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)成為了制備單克隆抗體的快速且高效的手段。

雖然從特定疾病的免疫抗體庫(kù)中分離出的單克隆抗體相較之下具有更好的特異性，但由于技術(shù)和成本的影響，目前大多針對(duì)傳染病的單克隆抗體仍然是通過天然抗體庫(kù)分離而來。從實(shí)用性看，天然文庫(kù)的無偏性更好，幾乎可以篩選出針對(duì)所有靶分子的單克隆抗體。且可以重復(fù)利用于多種疾病的單克隆抗體的開發(fā)，不必為每個(gè)新疾病都重新建立免疫抗體庫(kù)。盡管來源于天然文庫(kù)的單克隆抗體特異性稍差，但相較時(shí)間和成本，其還是成為了目前使用噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的一個(gè)普遍選擇。

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