一,、噬菌體展示抗體庫技術(shù)概述

單抗的制備方法和技術(shù)主要包括免疫血清提取法、雜交瘤技術(shù),、單個B淋巴細(xì)胞抗體制備技術(shù)和噬菌體抗體庫技術(shù)等,。在上一篇文章中,，我們主要講述了關(guān)于雜交瘤技術(shù)的簡介和關(guān)鍵點，本篇文章旨在介紹噬菌體抗體庫技術(shù),。

簡介

噬菌體展示抗體庫技術(shù)(phage display antibody library technology, PDAT)是一種新型的單克隆抗體制備技術(shù),，是一種基于噬菌體展示技術(shù)(phage display technology, PDT)的抗體制備技術(shù)。

PDT是由美國生物學(xué)家Smith于1985年發(fā)明,，他通過將外源基因序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因中,，使外源蛋白與噬菌體的外殼蛋白融合表達(dá)，并展示在子代噬菌體的表面,。PDT突破性地在體外建立了蛋白表型與其遺傳信息的直接聯(lián)系,，并保持了蛋白的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。

PDAT能夠在體外模擬體內(nèi)的抗體生成過程,，在體外進(jìn)行試驗并靈活篩選,，可以不經(jīng)雜交瘤途徑，甚至不經(jīng)過免疫就可以制備和生產(chǎn)單克隆抗體,，是一種強(qiáng)大的用于制備全人源抗體的技術(shù)手段,。其制備抗體不依賴于體內(nèi)的免疫反應(yīng)，可用于發(fā)現(xiàn)針對幾乎所有類型抗原的抗體,，并且結(jié)合了PDT表達(dá)蛋白基因型和表型的統(tǒng)一的特點，通過表型篩選就能得到相應(yīng)的基因,，是制備單克隆抗體領(lǐng)域中繼B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)后的又一次飛躍,。而且相較于其它單克隆抗體的制備技術(shù)，PDAT具有抗體生產(chǎn)操作簡單,、周期短,、抗體結(jié)構(gòu)可塑性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣,、制備數(shù)量多,、抗體產(chǎn)量大、多樣性高和可直接生產(chǎn)人源化抗體等優(yōu)點,。

基本原理

PDAT的基本原理是將免疫球蛋白可變區(qū)VH,、VL基因重組后整合在噬菌體載體上，并以融合蛋白的形式將抗體表達(dá)到噬菌體表面,，再利用這些新噬菌體顆粒感染大腸桿菌,，噬菌體在菌體內(nèi)組裝，克隆基因與噬菌體的外殼蛋白基因一同表達(dá)在成熟噬菌體的表面,，從而獲得多樣性抗體庫,。抗體庫經(jīng)過“吸附-洗脫-擴(kuò)增”過程即可篩選獲得到特異結(jié)合抗原的抗體分子及其基因序列,。

類型

1,、不同基因來源：

噬菌體展示抗體庫可根據(jù)抗體基因序列的來源分為免疫抗體庫和非免疫抗體庫,。

（1）免疫抗體庫里的抗體基因主要來自于經(jīng)抗原免疫的個體，采用經(jīng)過免疫后的淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的IgG-mRNA直接建立抗體庫,，由于存在免疫偏好性,，因此從該類抗體庫中容易篩選出針對與某一特定抗原不同表位、具有不同特異性的高親和力抗體克隆,。因為在體內(nèi)淋巴細(xì)胞已經(jīng)過與抗原的親和力選擇,，所以建立小容量的抗體庫即可篩選出特異性強(qiáng)的高親和力抗體。但是這種抗體庫有著明顯的缺點,，即免疫個體本身就有限制性和偏好性,，且只能產(chǎn)生針對特定抗原的特定抗體，其通量小,，存在需要進(jìn)行主動免疫的缺陷,。

（2）非免疫抗體庫可識別的抗原具有多樣性，包括那些不引起機(jī)體免疫反應(yīng)的弱抗原,、自身抗原和具有毒性的抗原,，理論上能夠制備大量的多樣性抗體。非免疫抗體庫的特點是不針對特定的抗原,，建立多樣性強(qiáng)的抗體庫,，最大可能分離出高親和力的抗體，一般又分為天然抗體庫,、半合成抗體庫和全合成抗體庫,。

①天然抗體庫是采用未經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞建立的抗體庫，可獲得全部的抗體可變區(qū)序列,，而且不易遺漏抗體基因,，通常是利用未免疫者體內(nèi)IgM-mRNA構(gòu)建而成的，該抗體庫可用于分離針對所有類型抗原的抗體,，從天然抗體庫中分離出的抗體親和力主要取決于抗體庫的多樣性,。

②半合成抗體庫為人工合成一部分可變區(qū)，其余部分來自于天然抗體的合成抗體庫,。而全合成抗體庫是指可變區(qū)都由人工合成的抗體庫,。

2、不同噬菌體展示系統(tǒng)：

噬菌體抗體庫技術(shù)可以選擇不同的噬菌體來進(jìn)行抗體的展示,，具體可分為T4,、T7 、λ 噬菌體和絲狀噬菌體展示系統(tǒng)等,。

（1）T4噬菌體是肌病毒科的一種烈性噬菌體,。結(jié)構(gòu)相較于絲狀噬菌體更為復(fù)雜，為二十面體結(jié)構(gòu),，具有線性雙鏈DNA,。其衣殼蛋白中含有2種非必需外殼蛋白：小外衣殼蛋白(SOC)和高抗原外衣殼蛋白(HOC),，它們不影響噬菌體的正常活性因而可以作為外源基因的結(jié)合位點來展示外源蛋白,。T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配,，不需通過分泌途徑，因而可展示多種大小的多肽或蛋白質(zhì)而很少受到限制,，并且SOC和HOC蛋白拷貝數(shù)較多,，可以進(jìn)行多價展示。

（2）T7噬菌體是短尾病毒科的一種烈性噬菌體,，是一種雙鏈絲狀DNA烈性噬菌體,，成熟的噬菌體通過細(xì)胞裂解而釋放，展示在T7表面的多肽或蛋白質(zhì)不需要通過細(xì)胞膜分泌出來,，因而其表面展示多肽和蛋白的范圍較廣,。在T7噬菌體展示系統(tǒng)中，用于展示多肽和蛋白的衣殼蛋白主要是gp10A和gp10B,，其中g(shù)p10B蛋白位于噬菌體表面,，用于噬菌體展示系統(tǒng)。T7噬菌體比起絲狀噬菌體的增殖速度更快,，可節(jié)省克隆和篩選的時間,，廣泛應(yīng)用于篩選不同分子量、不同親和力的蛋白質(zhì),。

（3）λ噬菌體是長尾病毒科的一種溫和噬菌體,，具有線性雙鏈DNA分子，與T4噬菌體相同為二十面體,，主要進(jìn)行裂解性生長和溶源性生長,，λ 噬菌體中的GPD蛋白和PV尾蛋白常被用來展示多肽或蛋白,。λ噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)完成裝配,，同樣無需將外源肽或蛋白分泌到細(xì)菌胞膜外，可展示的蛋白質(zhì)范圍極廣,。

（4）絲狀噬菌體主要指具有感染革蘭氏陰性菌能力的M13,、Fd和F1噬菌體，其中M13噬菌體在噬菌體展示技術(shù)中應(yīng)用最廣泛,。

M13噬菌體為一個絲狀長管結(jié)構(gòu),，一個環(huán)狀單鏈DNA基因組編碼5個外殼蛋白（ｐⅢ、ｐⅥ,、ｐⅦ,、ｐⅧ和ｐⅨ）以及6個組裝和復(fù)制蛋白。大多數(shù)噬菌體展示系統(tǒng)基于外殼蛋白ｐⅢ蛋白與ｐⅧ蛋白,。ｐⅧ是M13噬菌體上主要的外殼蛋白,，可與6-7個氨基酸大小的外源蛋白融合表達(dá),。而ｐⅢ的拷貝數(shù)較低但可作為表達(dá)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的較大蛋白載體。由于絲狀噬菌體的增殖為非裂解增殖,，在增殖期間不會裂解宿主菌,，因此該噬菌體在實驗淘選過程中，只需將菌液離心后取上清并沉淀即可得到噬菌體,，減少了因細(xì)胞裂解后需對噬菌體純化的步驟,，縮短了實驗所需時間。

3,、不同載體類型

噬菌體抗體庫技術(shù)中常用的載體包括噬菌體載體和噬菌粒載體,。

（1）噬菌體載體是基因工程中常用的載體，將外源基因替代或插入到噬菌體基因組當(dāng)中,，組成噬菌體載體,。大多數(shù)噬菌體載體表面有多個蛋白展示位點，通常為多價展示,。一般情況下,，多價展示會使弱結(jié)合性克隆顯示出假陽性，不易篩選特異性高的克隆,，但在利用噬菌體展示多肽時,，由于多肽與抗原的結(jié)合能力較弱，反而在多價展示的情況下更有益于篩選到目的克隆,。相反單價展示可以提高篩選到高親和力克隆的可能性,，因此人們選擇利用噬菌粒作為載體，通過單價展示進(jìn)行高親和力的篩選,。

（2）噬菌粒是帶有絲狀噬菌體復(fù)制起始點的質(zhì)粒,，是一類人工構(gòu)建的含有絲狀噬菌體包裝序列、復(fù)制子,，以及質(zhì)粒復(fù)制子,、克隆位點、標(biāo)記基因的特殊類型的載體,，兼具絲狀噬菌體與質(zhì)粒的優(yōu)點,。噬菌粒具有基因組較小可插入較大片段、復(fù)制型為雙鏈DNA,、易于操作,、轉(zhuǎn)化效率高和產(chǎn)生的重組子更加穩(wěn)定等優(yōu)點。但由于噬菌粒本身不含噬菌體蛋白編碼基因,，導(dǎo)致噬菌粒不能獨立合成單鏈DNA,，在導(dǎo)入大腸桿菌后不產(chǎn)生子代噬菌體，感染時要用輔助噬菌體,，輔助噬菌體編碼的噬菌體蛋白可將絲狀噬菌粒DNA包裝成噬菌體病毒顆粒釋放出來,，且能再次感染大腸桿菌而繁殖,。

4、不同抗體類型

傳統(tǒng)的全抗體由于分子量較大,，不易于展示在噬菌體表面,，因此噬菌體抗體庫技術(shù)主要用于制備scFv、Fab,、二硫鍵穩(wěn)定性抗體(DsFv),、雙鏈抗體(diabody)或小抗體(minibody)等（圖1）。

（1）scFv是利用基因工程的方法將抗體的VH與VL通過一段15?25個氨基酸的linker連接構(gòu)成的重組蛋白,，是具有抗體活性的最小功能結(jié)構(gòu)單位,，其分子量約為完整抗體分子的1/6。scFv的優(yōu)勢是分子量小,、穿透力強(qiáng),，但容易形成聚體，構(gòu)建成完整分子后親和力可能會缺失,。

（2）Fab是一種完整抗體的片段,，由VH與重鏈恒定區(qū)CH1以及一條完整的輕鏈即VL與輕鏈恒定區(qū)CL組成，二者之間由一個鏈間二硫鍵連接,，形成異二聚體,，僅有一個完整的抗原結(jié)合位點，其分子量約為完整IgG分子的1/3,。相較于scFv庫,，F(xiàn)ab的形式更接近于完整抗體，其穩(wěn)定性更好,，但其表達(dá)水平較低,。

（3）DsFv是通過在VH和VL之間形成二硫鍵來穩(wěn)定Fv片段。與scFv相比,，DsFv的穩(wěn)定性和親和力更高,，同時也具有scFv小分子的優(yōu)勢，在臨床上具有很高的應(yīng)用價值,。

（4）雙鏈抗體由2個交叉的單鏈抗體scFv組成,，由于連接用的linker將每個輕鏈重鏈的可變區(qū)分隔開,，所以只能形成二聚體,。

（5）小抗體通過基因工程手段采用不同的linker把scFv的VH與IgG的重鏈恒定區(qū)CH3融合，形成VL-VH-CH3的結(jié)構(gòu),，稱之為小抗體,。

二、噬菌體展示抗體庫技術(shù)流程

使用噬菌體展示技術(shù)制備單克隆抗體的基本步驟包括：

1,、從體外細(xì)胞中提取總RNA,，細(xì)胞類型可選免疫后的動物脾細(xì)胞,、雜交瘤細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞,、末梢血淋巴細(xì)胞,、骨髓淋巴細(xì)胞等。

2,、反轉(zhuǎn)錄總RNA得到細(xì)胞的cDNA文庫,，利用PCR技術(shù)以相應(yīng)引物從中擴(kuò)增獲得全套的可變區(qū)基因，包括重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL基因,，隨機(jī)拼接VH和VL基因構(gòu)建多樣性的抗體基因庫,。

3、將抗體基因克隆至M13噬菌體表達(dá)載體噬菌粒上,，通過電擊方式轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中,，并加入輔助噬菌體M13KO7侵染大腸桿菌，使得噬菌體在菌體內(nèi)增殖擴(kuò)增,，最后組裝成含有特定抗體或抗體片段基因,，并能將抗體表達(dá)展示在表面的重組噬菌體庫，根據(jù)絲狀噬菌體特性,，將菌液離心后取上清,，并對上清中噬菌體進(jìn)行沉淀即可得到針對某種抗原的初級噬菌體抗體庫。

4,、選擇特定抗原作為靶點目標(biāo),，對建立的初級抗體庫通常進(jìn)行2?5輪重復(fù)的篩選。在篩選過程中有2個主要的步驟分別是淘選和單克隆鑒定,。

（1）噬菌體的淘選

創(chuàng)建文庫后,，就可使用固定抗原進(jìn)行抗原特異性噬菌體抗體的富集，這一步被稱為噬菌體淘選,。淘選分為吸附,、洗滌、洗脫和擴(kuò)增4個過程,。

①吸附：需將抗原固定在固相載體上,，加入噬菌體抗體庫后，使得表達(dá)特異性抗體的噬菌體與抗原結(jié)合,。

②洗滌：隨著淘選輪數(shù)的增加,，逐步減少抗原包被濃度、增大洗滌液中Tween20濃度或逐步增加洗滌次數(shù),，洗去不結(jié)合或結(jié)合較弱的噬菌體,，篩選出親和力更高的噬菌體。

③洗脫：洗去未結(jié)合或結(jié)合較弱的噬菌體后，需要洗脫與抗原結(jié)合的高親和力噬菌體,。最常用的例如胰酶,、甘氨酸、檸檬酸等酸性或堿性緩沖液,。但需注意要把洗脫噬菌體的pH值中和到８左右,，以避免噬菌體降解或失去感染性。

④擴(kuò)增：結(jié)合的噬菌體從靶標(biāo)上洗脫回收,，取少量噬菌體進(jìn)行濃度滴定檢測,，用于后續(xù)根據(jù)投入產(chǎn)出比計算富集因子；部分重新感染大腸桿菌TG1并加入輔助噬菌體增殖,，進(jìn)行下一步淘選和濃縮,；剩余部分凍存保種。

（2）單克隆鑒定

經(jīng)過數(shù)輪淘選,，與固定相特異性結(jié)合的噬菌體展示目的抗體被富集并分離出來,，由于抗體的編碼基因序列與噬菌體載體上的序列一一對應(yīng)，所以幾輪淘選后,，將富集到的與抗原特異性結(jié)合的多克隆噬菌體進(jìn)行單克隆化,，即可從多克隆噬菌體中挑選出單克隆噬菌體。

挑選出的單克隆菌株轉(zhuǎn)接至96孔板中,，取其單克隆培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測,，根據(jù)結(jié)果可得到高特異性單克隆菌株，并通過測序手段獲得由單克隆噬菌體展示的抗體基因,。

通過噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的過程省略了細(xì)胞融合過程中繁瑣的步驟,，也避免了因為雜交瘤細(xì)胞的不穩(wěn)定性而需要進(jìn)行反復(fù)亞克隆的過程。使得噬菌體抗體庫技術(shù)成為了制備單克隆抗體的快速且高效的手段,。

雖然從特定疾病的免疫抗體庫中分離出的單克隆抗體相較之下具有更好的特異性,，但由于技術(shù)和成本的影響，目前大多針對傳染病的單克隆抗體仍然是通過天然抗體庫分離而來,。從實用性看,，天然文庫的無偏性更好，幾乎可以篩選出針對所有靶分子的單克隆抗體,。且可以重復(fù)利用于多種疾病的單克隆抗體的開發(fā),，不必為每個新疾病都重新建立免疫抗體庫。盡管來源于天然文庫的單克隆抗體特異性稍差,，但相較時間和成本,，其還是成為了目前使用噬菌體展示技術(shù)篩選單克隆抗體的一個普遍選擇。

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